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北京六一SDS-PAGE電泳檢測桑種子純度的蛋白質提取液篩選

2020-12-20
為了利用蛋白質凝膠電泳檢測桑種子純度, 對采用SDS-PAGE電泳及定量分析的PO4 、EX3 、ddH2O以及20%和 30%2-氯乙醇等 4種桑種子蛋白質提取液進行了篩選。 結果表明, EX3 為適合SDS-PAGE電泳的桑種子蛋白質提取液, 其最佳提取用量、點樣量分別為60.30微升。

田間種植桑樹是鑒定桑品種真實性和檢測桑種子純度最為可靠 、準確的方法, 但其檢驗周期長 ,且易受環境及病蟲害等因素的影響。 DNA分子標記檢驗雖分辨率高 ,但存在費用高、操作繁瑣等缺點 。采用電泳分離的蛋白圖譜檢測農作物種子純度已有報道[ 1 -3]。利用種子蛋白質電泳圖譜鑒定種子純度具有不需將種子萌發 、送檢樣品可及時進行分析、電泳后的染色步驟相對簡單等優點, 因而利用電泳圖譜鑒定桑種子純度的方法值得探討。應用該方法檢測雜交桑種子純度時, 首先需建立雜交桑種子自身的標準蛋白質圖譜作為對照。為了建立準確 、清晰的標準蛋白質圖譜 , 本試驗對蛋白質凝膠電泳(SDS-PAGE)中桑種子蛋白質提取液的種類進行了篩選, 并應用梯度法研究了提取液的用量及點樣量 。
1  材料與方法
1.1  桑品種及桑種子蛋白質提取的處理方法
供試桑品種為沙 2×倫 109、粵桑 11號。將供試桑品種的種子冷藏 30 min后研磨, 將研磨粉碎的單粒種子置于離心管中 ,加入蛋白質提取液,室溫下提取 1 h后,置于旋渦混合器上混勻約 1m in,然后放入冷凍離心機中10 000 r /min離心 10min。取其上清液用于電泳 。
1.2 SDS-PAGE電泳方法
參照文獻 [ 4]的方法 , SDS-PAGE凝膠配制采用不連續垂直電泳用的配方, 其分離膠和濃縮膠的質量分數分別為 12.5%、5%, 電壓 100 V, 電泳約 3h,采用考馬斯亮藍染色 , 掃描獲得電泳圖譜。主要試劑丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺 、SDS、AP、TEMED、Tris、考馬斯亮藍 G-250等由生物公司進口分裝 , 其余的試劑甘油 、甲醇、冰乙酸 、尿素、乙二醇等從化玻店購買 。

1.3  蛋白質提取液的篩選
參照文獻[ 5]的方法, 將 PO 4 、EX 3 、ddH 2 O以及20%、30%的 2-氯乙醇 5種提取液各設 5個處理,每個處理 點 2 個 樣 品。 PO 4 提取 液 :將 0.038 8 gK 2 HPO 4 、0.010 56 g KH 2 PO 4 、5.0 mL 甘油 、0.2 gDTT、0.076 g EDTA溶于 200 mL雙蒸水中 。 EX 3 提取液:將 32.43 g尿素 、120 μL乙二醇溶于 1 000mL雙蒸水中。以上藥品除 2- 氯乙醇為化學純外 , 其余均為分析純 。
1.4  蛋白質提取液的定量分析
用經過篩選的提取液處理單粒桑種子, 然后各取 40 μL上清液進行種子的蛋白含量測定 , 設 3個重復。 用紫外分光光度 法測定, 以牛血清蛋白(BSA)作為標準蛋白, 具體方法如下。首先用紫外分光光度計在 595 nm 波長下測定質量分數為10%、20%、30%、40%、50%、60%的牛血清溶液 ,用于測定沙 2 ×倫 109種子蛋白質含量的吸收值分別為 0.033、0.060、0.089、0.136、0.169、0.203,用于測定粵桑 11號種子的牛血清溶液的吸收值分別為0.010、0.046、0.062、0.083、0.147、0.162。然后 ,根據 6個吸收值建立沙 2 ×倫 109種子的方程 y =0.003 5x - 0.007 4, R2=0.994 3;粵桑 11號種子的方程 y =0.003 1x - 0.023 4, R2=0.961 9。最后在595 nm 波長下測定各上清液的吸收值 ,根據方程可算出各樣品提取液提取的種子蛋白質含量 。
1.5  提取液用量的篩選
從選擇的提取液中分別以 60、70、80、90、100、110、120、130、140 μL的用量來提取單粒種子蛋白 ,點樣量為 25 μL上清液, 進行不同用量的梯度電泳 。
1.6  點樣量的篩選
以最佳提取液用量處理單粒種子后, 分別選用18、20、23、25、28、30 μL的上清液點樣量進行電泳。
2  結果
2. 1  蛋白質提取液種類的篩選
用 100 μL提取用量處理單粒種子后, 取 25 μL的上清點樣 ,從電泳圖譜 (圖 1、2)可見試驗種子在以 20%、30%的 2-氯乙醇作提取液時得到的蛋白質條帶不明顯, 以 PO4 、EX3 、ddH2O 作提取液則都可看到蛋白質條帶 ,且條帶數基本一致 ,而 EX 3 的染色相對清晰,條帶分離較好。

2.2  蛋白質提取液的定量分析
表 1 所示的 試驗 數據反 映出 經過 篩選 的ddH2O、PO4 、EX3 等 3種提取液提取的桑種子的蛋白質含量都較低, 但用 EX 3 提取液提取的種子蛋白質含量相對較高,與上述電泳帶的清晰度相符,且種子純度的測定可在單粒種子的前提下進行, 因而在SDS-PAGE電泳中選擇 EX 3 作為桑種子首選蛋白質提取液。
2.3  提取液用量的篩選
如圖 3所示, 60 μL用量的桑種子蛋白質條帶較清晰,但條帶的清晰度有隨著提取液用量的增加而變弱的趨勢 。因此 ,在 SDS-PAGE電泳中選擇 60μL EX3 提取液較適宜單粒桑種子蛋白質提取2.4  點樣量的篩選如圖 4所示 , 6個點樣量都能測出桑種子的蛋白質圖譜, 30 μL的點樣量的條帶分離度相對較好 、且較清晰,故選擇點樣量為 30 μL。

3  討論
本試驗結果可知 , 用 EX3 提取液提取的桑種子蛋白質含量較高,電泳條帶相對清晰一些,提取液用量 60 μL、點樣量 30 μL的效果較好 。桑種子的質量小 ,其脂肪含量較高 (占 33.4%), 而蛋白含量較低(只有 25%)[ 6],故能從種子中提取的蛋白質含量也不高。提取桑種子的蛋白量和提取液用量、點樣量均會影響到電泳條帶的清晰度 ,在 SDS-PAGE電泳中也表現出提取蛋白量多 、提取液用量少 、點樣量多時電泳條帶則相對清晰一些。今后的工作期望能在定量的電泳方法下建立生產上常用的雜交桑種子標準蛋白質圖譜,最終建立經濟、簡便、快速 、實用的電泳方法用于桑種子純度的測定 。

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